Sin stock: retos para el diagnóstico del Sars-CoV-2

El desarrollo de una vacuna contra el Sars-CoV-2 no es el único desafío que enfrentan los científicos y gobiernos desde diciembre de 2019, luego de que el brote de casos por una neumonía desconocida pusiera al planeta en alerta. Ante la virulencia de este nuevo patógeno otra carrera contra el tiempo comenzó: la capacidad diagnóstica, dada la necesidad de identificar quiénes estaban contagiados para frenar la dispersión del patógeno mediante la cuarentena.

En términos prácticos ya había camino recorrido, técnicas para detectar el material genético del virus ya existían y, gracias a esfuerzos internacionales, se logró identificar la secuencia genética completa del virus en sólo 10 días. Con eso, ya sabíamos qué buscar y con qué herramienta buscarla. Sin embargo, nos encontramos con un nuevo obstáculo, es tal la rapidez de contagio y la penetración que ha tenido el Sars-CoV-2 en diversas naciones, que en algunos servicios de salud se están quedando sin los insumos básicos para realizar los exámenes, mientras que en otros el personal no da abasto para procesar todas las muestras.

Aunque muchos de los gobiernos fueron escépticos en un principio, actualmente hasta líderes como Boris Jhonson han adoptado políticas que limitan la circulación y el desplazamiento regular de las personas, manteniendolas en sus casas, con tal de prevenir un escalamiento mayor de infectados. Estas medidas, aunque duras, responden a la facilidad y rapidez con la que el virus se propaga, y a las limitaciones técnicas que existen para diferenciar aquellos individuos que están contagiados, de aquellos sanos. Esto, principalmente debido a que varios síntomas son comunes con otras enfermedades virales: fiebre, tos, dolores de cabeza o fatiga; y que la diversidad de síntomas asociados al COVID-19 está en constante aumento. 

Además, no basta con identificar y aislar a aquellos que presentan tos o fiebre, ya que se han reportado casos de pacientes asintomáticos, que contribuyen a esparcir el virus. Por eso, es fundamental corroborar su presencia a través de un examen diagnóstico.

El profesor del Instituto de Ciencias Biomédicas de la Universidad de Chile y parte de la Red de Laboratorios Universitarios para la detección del Coronavirus en Chile, Fernando Valiente, en entrevista con Chile Científico abordó las principales limitantes y desafíos para el diagnóstico de COVID-19 a través de RT-qPCR. 

El académico alertó sobre la situación vivida hace un par de semanas cuando una escasez de tórulas para la recolección de las muestras biológicas afectó a todo el mundo. Adicionalmente, advirtió sobre la posible escasez de algunos elementos para la detección del virus a través de RT-qPCR, como el kit de extracción de material genético o el kit one-step para el desarrollo del RT-qPCR de manera automatizada. Por esta razón, alrededor de cuatro laboratorios del país se encuentran diseñando nuevas estrategias que permitan obviar el  proceso de extracción de material genético  o utilizar reactivos químicos que sean independientes de los kit comerciales. La misma situación podría vivirse con la disponibilidad de los tubos plásticos que son necesarios para el examen.

En esta revisión presentamos y explicamos las dos técnicas de laboratorio más usadas para el diagnóstico de Covid-19: detección por RT-qPCR y el conocido test rápido, basado en el uso de anticuerpos. 

PCR: Lento, pero seguro

Una revisión del Centro de Prevención y Control de Enfermedades de Estados Unidos describe a la Reacción en Cadena de la Polimerasa en Tiempo Real con Transcriptasa Inversa (RT-qPCR por su nombre en inglés) como la técnica “gold standard”, es decir, aquella con la máxima fiabilidad a la hora de diagnosticar COVID-19, debido a que ofrece la mayor sensibilidad de detección y cuantificación del virus en etapas tempranas de la enfermedad. 

La técnica general de Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR convencional) es una técnica de biología molecular que data de fines de los 80 y que es ampliamente utilizada, tanto en laboratorios clínicos como en los de investigación, ya que permite obtener grandes cantidades de copias de una determinada región del ADN (material genético) de una muestra biológica, microorganismos o virus. Esta región corresponde a un marcador genético (una fracción única y específica, como un código de barras o una huella digital) para determinar su presencia en una muestra, aún cuando esta puede ser muy reducida.

En la técnica de PCR, la Enzima Transcriptasa Reversa lee el ARN del virus y, posteriormente, lo convierte en una secuencia nucleotídica llamada ADN complementario (ADNc), que funciona como un código de barras que permite identificarlo. Esta cadena complementaria es la que finalmente se copiará miles de veces, por otra enzima llamada ADN polimerasa quem con la ayuda de los partidores (cadenas cortas de ácidos nucleicos que le indicarán el punto de partida de la secuencia), realizarán millones de copias de la fracción de interés del ADNc del virus. 

En el caso del diagnóstico para SARS-CoV-2, se analiza una muestra biológica de fluido bucofaríngeo o amígdala, mediante una variación de la técnica convencional de PCR: el RT-qPCR. Esta técnica convierte el ARN del virus en ADN mediante la acción de la enzima Transcriptasa Reversa, lo que permite la detección y cuantificación de los nucleótidos (unidad básica del material genético) del virus. 

Cada copia que se genere de la fracción de ADNc de interés quedará unida a una molécula fluorescente (fluorocromo) que es capaz de ser detectada por un equipo de medición llamado termociclador.. Mientras más material genético de interés (del virus en este caso) tenga inicialmente una muestra, más copias de ADNc se generarán, más fluorocromos habrán y, por lo tanto, mayor será la señal que detecte el termociclador, lo que indicará la cantidad de ARN de la muestra inicial. 

Si este examen es realizado a una muestra biológica proveniente de una persona que no se encuentre infectada por SARS-CoV-2, el virus no estará presente, por lo que no se replicará la fracción que se asocia a una molécula fluorescente y el termociclador no detectará ninguna señal. 

A pesar de la alta capacidad de diagnóstico de esta técnica, no está exenta de limitaciones, que se relacionan con las extensas horas de trabajo de profesionales certificados que requiere su realización, grandes cantidades de materiales como kits de extracción de material genético, termocicladores, tubos y reactivos químicos, que ya comienzan a escasear; y materiales y equipos de transporte de las muestras, que hacen de esta técnica un método costoso de detección de COVID-19.  

Test rápidos basados en detección de anticuerpos

Las inmunoglobulinas (Ig), también conocidas como anticuerpos, son proteínas producidas por el sistema inmune cuando se encuentra en presencia de una agente infeccioso. Su función es unirse a este patógeno, inactivarlo y, además, hacer de centinela, ya que alertan a las células del sistema inmunológico para que puedan identificarlo de manera rápida y así eliminarlo. 

Este es un proceso con muchos actores involucrados. En los mamíferos existen cinco clases o isotipos de anticuerpos: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM. Todos ellos comparten la misma estructura, pero se diferencian en las propiedades biológicas que poseen, el período en que se producen ante un patógeno, su distribución dentro del organismo y en su capacidad para reconocer a los diferentes antígenos, moléculas presentes en los patógenos que pueden ser reconocidas por el sistema inmune.

Las pruebas de detección mediante anticuerpos del COVID-19, se basan en esta capacidad de unión específica, ya que una persona que se encuentre contagiada con Sars-CoV-2 producirá anticuerpos específicos contra el virus. Estos llamados “tests rápidos” cuentan con una membrana que almacena el antígeno del virus, si la muestra biológica del paciente (una gota de sangre) presenta los anticuerpos, estos se unirán y desencadenará una reacción colorimétrica que, de manera muy similar a los test de embarazo, mostrará una marca positiva en el dispositivo. 
Esta técnica depende tanto de que el paciente infectado efectivamente haya desarrollado los anticuerpos, como también de cuándo se realizó el contagio, ya que la aparición de esta línea de defensa no es inmediata. Por ello, existen dos pruebas para la detección de SARS-CoV-2 que comparten el mismo fundamento y procedimiento, pero se diferencian en los isotipos de inmunoglobulinas que detectan: IgG y IgM.

Los anticuerpos del tipo IgM son los que más rápidamente se forman en respuesta a un estímulo antigénico y representan del 5 al 10 % de las inmunoglobulinas totales. Mientras que las IgG, que representan al 70%, se sintetizan tardíamente luego de la infección por un patógeno, por lo que su medición se asocia a etapas tardías de la enfermedad.

Cuándo se toma la muestra y de dónde se obtienen son factores claves para evaluar los resultados de esta técnica de detección, y los resultados aún son inconclusos. Por ejemplo, en un estudio realizado en China, se observaron diferencias importantes en las tasas de positividad de resultados en pacientes con COVID-19 (medida por RT-qPCR), dependiendo del tipo de muestra que se analizó: 93% en fluido de lavado broncoalveolar, 63% en hisopo nasal y 32% en hisopo faríngeo. 

Otro estudio del mismo país, analizó la carga viral en muestras de esputo y de garganta (por hisopo) en distintos puntos del transcurso de la infección y los resultados mostraron que la mayor carga viral se presentaba alrededor de 5-6 dpas (días posteriores a la aparición de síntomas) y que entre 9-12 dpas, la carga viral dejaba de ser detectable . 

Estas variaciones en la capacidad de detectar una infección por COVID-19 también se evidencian a través del testeo basado en anticuerpos. Un estudio registró que la tasa de positividad para testeos basados en IgM, aumentaron desde un 11.1% en etapa temprana (1-7 dpas) a un 78,6% en etapa intermedia (8-14 dpas). De la misma forma, los testeos basados en IgG aumentaron  su positividad desde un 3,6% en etapa temprana a un 57,1% en etapa intermedia, llegando a un 96,8% en etapa tardía (más de 15 dpas).

Limitaciones y desafíos para la detección por RT-qPCR en los laboratorios.  

A pesar de que la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real es considerada el gold standard para la detección de SARS-CoV-2, esta técnica tiene limitaciones importantes, ya que requiere laboratorios certificados, equipo y reactivos químicos costosos; y profesionales capacitados. Por su parte, las pruebas rápidas para la detección de anticuerpos específicos contra el SARS-CoV-2 son simples y pueden proporcionar confirmación rápida de la infección de COVID-19. No obstante, su capacidad de diagnóstico presenta mayores tasas de falsos negativos, comparadas con el RT-qPCR, especialmente cuando las muestras biológicas para el análisis se recolectan en la fase temprana de la aparición de síntomas. 

Aún no se sabe con claridad las variaciones en las respuestas inmunes de pacientes asintomáticos o con sintomatología leve. Por lo tanto, es posible que los test serológicos marquen negativo, cuando PCR puedan dar positivo. No obstante, se ha observado que pruebas combinadas de medición de IgM y IgG tienen una mejor utilidad y sensibilidad en comparación a una sola prueba de IgM o IgG. De esta manera, el estudio combinado de ambos anticuerpos puede ser de mayor utilidad para la detección rápida de portadores de SARS-CoV-2 sintomáticos o asintomáticos, en hospitales, clínicas y laboratorios de pruebas. 

Al día de hoy, los datos del Ministerio de salud de Chile cifran en 313.750 exámenes de PCR realizados en todo el país y ya se encuentra en marcha el plan piloto en profesionales de la salud para la aplicación de 500 mil test rápidos. Son 73 los laboratorios los que se encuentran registrados en Chile para realizar el examen de diagnóstico de COVID-19 a través de RT-qPCR, lo que no ha estado exento de dificultades, ya que el día de ayer seis laboratorios de clínicas privadas anunciaron el cese del servicio debido a la falta de insumos y profesionales capacitados, mientras que el Hospital Clínico de la Universidad de Chile suspendió la recepción de muestras debido a un “quiebre de stock nacional” de los materiales para la realización del examen. 
Frente a este desafío, Fernando Valiente es tajante sobre la necesidad de fortalecer la industria nacional para solventar la falta de estos insumos de manera independiente y que no afecte la capacidad del país de realizar este examen a pacientes sintomáticos, estableciendo proyecciones a mediano y largo plazo. Sin embargo, ya estamos atrasados en esta carrera: las alternativas desarrolladas por las Universidades junto al Ministerio de Ciencia Conocimiento y Tecnología, además de tomar tiempo, recursos y trabajo, requieren validar sus pruebas de diagnóstico, para posteriormente ser certificados por la autoridad sanitaria (ISP) y, sólo después de este proceso, podrá implementarse en los servicios de salud para fortalecer la red de diagnósticos.

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